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  荧光定量PCR仪的热盖失效或故障最主要的表现是：控温不准和液体挥发，反应液挥发会最终导致曲线不扩增，呈斜线上升。首先可通过曲线判断热盖是否故障，若确定热盖已经坏了，建议可以在每个PCR反应管中加入一层矿物油（矿物油可避免反应液挥发），上机测试曲线结果是否正常。如曲线仍然异常，则建议请仪器工程师现场维修，甚至直接更换热盖。

　　通常凯发K8建议在实验室配备UPS电源，这样能够保证PCR仪器运行过程中的正常供电，从而保证程序的正常运行。PCR仪器在运行中突然断电的话，如仪器有断电保护功能，则可直接继续运行程序。如实验室无UPS电源，突然断电而导致PCR程序不能完成，为了保证实验结果的真实性，建议只能重复实验再上机检测。

要判断自己的PCR仪器是否正常，可从以下几方面考虑：1.    仪器开关机，与软件连接是否正常。2.    仪器运行同样的实验所需要的时间是否跟平时一致，由此判断仪器的加热制冷模块是否正常。3.    曲线结果是否呈明显的S型，若曲线异常，如呈曲折上升状，则可能是热盖问题，或者是荧光检测装置出现问题。4.    若曲线的荧光值与平时相比，明显降低，则要考虑是否需要更换仪器光源（尤其是卤素灯，其光源寿命约2000h）。5.    若仪器某一孔或几孔的荧光值明显高于其他孔位，则需要考虑仪器的孔槽或检测光路是否受到荧光污染，建议清洗仪器孔槽后再进行测试。

　　如实验室的扩增产物泄露，造成实验室的污染，那么后果将非常严重。要去除污染，首先最重要的是保持通风，保证扩增产物片段能顺利扩散出去；其次可采用稀酸处理法，对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波长（nm）一般选择254/300nm，需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大；最后若污染长时间不能消除，建议更换另外厂家的PCR试剂进行检测，因为每个厂家的引物设计区域不一样；一般情况下，一家试剂公司的扩增产物不会在另外一家厂家的引物设计区域内，因此不会造成产物污染的假阳性。

1）为了保证检测质量，临床PCR实验室应有充分合理的空间，良好的照明和空调设备。工作环境虽不是检测质量的直接原因，但宽敞舒适的实验室环境将肯定有利于检验质量的保证。

2）合理有效地对仪器设备进行管理，定期做维护和校准，使其处于一个良好的状态。例如，定期校准移液器，使其保持足够的准确度和精密度。定期维护荧光定量PCR仪的光学系统和反应孔间温度差异，使其保持在良好状态和允许的范围内。此外，还包括天平，离心机，冰箱等设备的管理。

3）理想的试剂：主要有内外两个因素，内在因素包括标本处理方法，用于核酸扩增的原材料及方法学设计等。外出因素包括试剂盒的运输和保存中的问题。

4）标准化操作流程：完整的临床PCR程序由标本采集，运送，保存，编号，试剂准备，核酸提取，扩增和产物检测，结果分析和报告等诸多环节，建立科学和与本实验室配套的SOP文件，严格按SOP进行操作。

5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有标本中的大量待测微生物，克隆质粒，大量存在实验室中的特定微生物以及以前扩增产物的残留污染等。这些都是实验室最容易造成假阳性的污染。因此，必须严格分区实验室及遵守工作流程，使用化学清洁实验台面，使用紫外线照射和UNG方法消除扩增产物污染等等。

6）进行室内和室间质量控制，室内质量控制可以确保实验室室内测定质量的一致性，室间质量控制可以提供将实验室测定情况与一室间和客观标准进行回顾性比较的数据。

　　国内外文献报道证实，乙肝两对半标志物全阴性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因为HBV DNA的检测窗口期出现早于乙肝血清标志物，因此此类患者可能处于乙肝感染早期。 　　乙肝感染后，在乙肝“两对半”检测中，表面抗原HBsAg出现最早，一般在感染3周后出现，而HBV DNA的检测能将窗口期缩短至6-15天，乙肝两对半全阴的标本HBV DNA为阳性，是因为病人处于感染乙肝病毒的初期，免疫学的检测窗口期比基因检测的窗口期长，导致两对半检测结果为阴性，由此可知：HBV DNA的检测，对于疾病的早期诊断有着非常重要的意义。

　　HBV-DNA检查是反应乙肝病毒复制程度和传染性大小的最直接指标。临床数据显示，在乙肝两对半大三阳病例  中，HBV DNA阳性的检出率极高，但HBV DNA阴性的结果也是很有可能的。一般乙肝大三阳HBV-DNA阴性虽然表明患者病毒未超标，但大三阳结果提示患者感染乙肝病毒，且具有较强传染性。尽管如此，临床检验者也可能遇到大三阳标本HBV DNA检测不出的情况。首先对于这样的标本，可以将标本进行稀释后进行复查，排除血清或血浆标本中存在抑制物或者阳性标本HBV DNA浓度超过试剂盒上限而导致PCR扩增失败的情况。其次，乙肝病毒发生变异也是导致PCR扩增不出的原因之一，通常都是用药治疗患者的乙肝病毒核酸序列发生了突变。如经过多种PCR试剂检测失败后，可进行DNA测序以确定乙肝病毒及其变异位点，以指导临床医生用药治疗。最后， 可更换另一厂家试剂进行检测，排除原试剂本身设计缺陷而造成漏检的情况。

实时荧光定量PCR扩增曲线包括基线期，指数扩增期，线性扩增期和扩增平台期，标准的曲线应该呈典型的S型。不规则曲线可以根据曲线的具体情况来分析：1）曲线呈斜线上升原因：热盖失灵或热盖没盖紧，导致控温不准、液体挥发。解决办法:更换仪器热盖或将热盖盖紧。图1 曲线呈斜线上升2）扩增曲线分成两段（断裂）图2扩增曲线分成两段（断裂）原因：基线的终点大于Ct值，通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值< 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致曲线被压下去。解决方法：减小基线终点，至Ct值前4个循环，重新分析数据。3）直线扩增曲线图3 某些样本出现直线扩增曲线原因：探针部分降解解决办法:建议更换试剂进行测试。4）曲线平台期下掉原因：盖子没盖紧解决办法:PCR反应管盖子盖上后，检查盖子是否盖紧。图4 曲线平台期下掉